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ELISA實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋步驟指南
本生(BUNSEN)為您詳細(xì)講解ELISA實(shí)驗(yàn)中稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的關(guān)鍵步驟和注意事項(xiàng)。這是實(shí)驗(yàn)成功與否的基石，精確的稀釋決定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量，從而直接影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。
一、核心原則
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋的目的是創(chuàng)建一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(通常為S型或線性化后的直線)。未知樣本的濃度將通過(guò)此曲線計(jì)算得出。因此，稀釋的精確性和一致性至關(guān)重要。
二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑與材料：
標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉:從冰箱中取出，室溫靜置15-20分鐘平衡至室溫。
標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液:務(wù)必使用試劑盒指定的專用稀釋液。不同的檢測(cè)目標(biāo)(細(xì)胞因子、激素等)可能需要不同的基質(zhì)(如血清、血漿模擬液)，以避免干擾。
去離子水或超純水：用于復(fù)溶凍干粉。
無(wú)菌離心管(1.5mL EP管)、試管或細(xì)胞培養(yǎng)板(用于系列稀釋)。
精確的可調(diào)移液器(如P1000, P200, P20)及匹配的、潔凈的低吸附吸頭。
渦旋混合器 和 小型離心機(jī)。
說(shuō)明書：
仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書，確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度(如 1000 pg/mL)和需要復(fù)溶的體積(如 500 μL)。
確認(rèn)說(shuō)明書建議的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍(如 7.8 pg/mL - 500 pg/mL)和稀釋倍數(shù)。常見的梯度是倍比稀釋(Serial Dilution)。
三、操作步驟
第一步：復(fù)溶
離心：將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉管短暫離心(如 3000 rpm, 1分鐘)，使粉末集中到管底，避免開蓋時(shí)損失。
加液：加入說(shuō)明書指定體積的去離子水或指定的復(fù)溶液。
混勻：輕輕渦旋(避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡)或上下吹打至少1分鐘，確保粉末溶解。切勿劇烈振蕩。
靜置：室溫靜置10分鐘，使其充分水化。此時(shí)溶液的濃度即為最高濃度儲(chǔ)備液(Stock Solution)。
第二步：配制最高濃度點(diǎn)
取一個(gè)潔凈試管，加入一定體積的稀釋液(例如 900 μL)。
吸取一定體積的復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(例如 100 μL)加入稀釋液中。
輕輕渦旋或吹打混勻。此管濃度即為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)(例如，1000 pg/mL儲(chǔ)備液稀釋10倍，得到 100 pg/mL的最高點(diǎn))。
示例：若儲(chǔ)備液為1000 pg/mL，要配制500 pg/mL的最高點(diǎn)，可采取1:1稀釋(如500μL儲(chǔ)備液 + 500μL稀釋液)。
第三步：系列倍比稀釋
這是最關(guān)鍵的一步。以制備7個(gè)濃度點(diǎn)為例(從最高濃度點(diǎn)開始稀釋)：
取7-8個(gè)排在一起的試管或孔板，除第一管外，每管加入等體積的稀釋液(例如 300 μL)。
第1管：加入與稀釋液等體積的“最高濃度點(diǎn)"溶液(例如 300 μL)，此時(shí)第1管濃度即為最高濃度(如 100 pg/mL)。
第2管：從第1管中吸取等體積液體(例如 300 μL)，移至第2管中。輕輕吹打或渦旋混勻。
后續(xù)管：重復(fù)此過(guò)程：從第2管取 300 μL 加入第3管，混勻;從第3管取 300 μL 加入第4管，混勻……直至稀釋到最后一管。
最后一管：從最后一管(濃度點(diǎn))中吸取 300 μL 液體并棄去，以保證所有管的體積一致。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)(本生提醒您)
低溫操作：對(duì)于非常不穩(wěn)定的蛋白，整個(gè)稀釋過(guò)程請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行，并使用預(yù)冷的稀釋液和器具。
避免吸附：使用低吸附的移液器吸頭和試管，以減少蛋白在管壁上的損失，這對(duì)于低濃度點(diǎn)尤其重要。
充分混勻：每一次轉(zhuǎn)移后都必須充分混勻，這是保證梯度準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。但需避免產(chǎn)生氣泡。
更換吸頭!每一步稀釋都必須使用新的無(wú)菌吸頭，否則會(huì)污染后續(xù)所有濃度，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
及時(shí)使用：稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡快加入酶標(biāo)板孔中，通常建議在30分鐘內(nèi)使用。
設(shè)置復(fù)孔：加樣時(shí)，每個(gè)濃度點(diǎn)建議做2-3個(gè)復(fù)孔，以提高數(shù)據(jù)的可靠性。
通過(guò)遵循以上步驟，您將能制備出一條準(zhǔn)確、可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為整個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)的成功奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產(chǎn)品說(shuō)明請(qǐng)咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商。
ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。本生試劑盒
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